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附件10 鳗鲡中恩诺沙星 环丙沙星 诺氟沙星 氧氟沙星残留量的测定

高效液相色谱-荧光检测法

  1、范围

  本指南规定了鳗鲡中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留量的测定方法。

  本指南适用于鳗鲡及其制品中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留量的测定。

  2、原理

  样品中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星用乙腈提取,用正己烷净化,用高效液相色谱荧光检测法测定,外标法定量。

  3、试剂和材料

  试验用水应符合GB/T6682中二级水的规定。所用试剂除另有指定外,均为分析纯。

  3.1 乙腈:色谱纯。

  3.2 酸化乙腈:乙腈+50%盐酸=2500+20(体积分数)。

  3.3 10%磷酸:磷酸+水=10+90(体积分数)。

  3.4 50%盐酸:盐酸+水=50+50(体积分数)。

  3.5 正己烷:分析纯,用乙腈饱和。

  3.6 乙腈水溶液:乙腈+水=20+80(体积分数)。

  3.7 无水硫酸钠:分析纯;经640℃灼烧4h后,贮于密闭容器中备用。

  3.8 0.01mol/L四丁基溴化铵溶液(pH=3.0):称取3.22g四丁基溴化铵,溶解于1000mL水中。用10%磷酸调节pH到3.0。

  3.9 恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星标准品:纯度≥99.0%。

  3.10 恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星标准储备液:分别称取恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星标准品10.0mg,用0.1mol/LHCl溶液10mL溶解,再用乙腈稀释定容于100mL棕色容量瓶中,此溶液浓度为100µg/mL。各标准储备液置于4℃~8℃冰箱中冷藏保存,保存期为一个月。使用时现配现用,先用乙腈水溶液配制溶液浓度为1.00µg/mL的标准混合溶液,然后用乙腈水溶液稀释至适当浓度。

  4、仪器和设备

  4.1 高效液相色谱仪,配有荧光检测器。

  4.2 高速组织捣碎机。

  4.3 旋转蒸发仪,配150mL蒸发浓缩瓶。

  4.4 离心机。

  4.5 振荡器。

  4.6 分液漏斗250mL

  4.7 尼龙微孔滤膜:0.45?m。

  4.8 高速分散器。

  4.9 微波炉

  4.10 精密分析天平(感量0.0001g);天平(感量0.01g)

  4.11 微量进样器或自动进样器:进样量50?L以上。

  5、色谱条件

  5.1 色谱柱:CloversilC18柱,250mm×4.6mm(i.d.),或相当者。

  5.2 流动相:0.01mol/L四丁基溴化铵(pH=3.0)+乙腈=94+6。

  5.3 流速:1.0mL/min。

  5.4 检测波长:激发波长280nm,发射波长480nm。

  5.5 柱温:40℃。

  5.6 进样量:40?L。

  6、样品测定

  6.1 试样制备

  取样品,弃头弃内脏弃骨(特殊要求时除外;蒲烧烤鳗须轻轻刮去表面酱油),带皮切成小块后,微波炉高火加热60s,用高速组织捣碎机捣碎混匀。

  6.2 提取与净化

  准确称取匀质样品约10g(精确至0.01g)于50mL塑料离心管,加入10g无水硫酸钠,加30mL酸化乙腈,用高速分散器于15,000rpm高速分散0.8min~1.5min后,3500rpm离心3min,取上清液转移至分液漏斗,残渣用30mL酸化乙腈重复提取一次,合并上清液于上述分液漏斗中,然后加入60mL乙腈饱和正己烷溶液,置振荡器上高速振荡5min,静置分层。收集下层乙腈于蒸发浓缩瓶中,然后置40℃水浴上减压蒸发浓缩至干,准确加入1.0mL乙腈水溶液清洗残渣,转移至离心管,于4000rpm离心3min,吸取清液用尼龙微孔滤膜过滤,滤液待测。

  6.3 测定

  6.3.1 标准工作曲线的制作

  分别准确移取浓度为1.0µg/mL的标准混合液50µL,100µL,250µL,500µL,700µL,1000µL于试管,加乙腈水溶液至1.0mL,混匀,配成浓度分别为0.05µg/mL,0.1µg/mL,0.25µg/mL,0.5µg/mL,0.7µg/mL,1.0µg/mL的标准混合溶液系列,供高效液相色谱分析,制作标准工作曲线。

  6.3.2 液相色谱测定

  根据样品溶液中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留量情况,选定峰面积或峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样品溶液中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样品溶液等体积参插进样进行测定。在上述色谱条件下标准品保留时间参考值分别为:氧氟沙星11.5min;诺氟沙星14.3min;环丙沙星16.9min;恩诺沙星23.6min(见图1)。

Minutes

氧氟沙星(11.5)、诺氟沙星(14.3)、环丙沙星(16.9)、恩诺沙星(23.6)

图1氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星标准色谱图(浓度0.1µg/mL,进样量40µL)

  6.3.3 空白试验与空白添加回收试验

  每个试验批次的样品中至少必须同时做另外两个样品,包括1个空白样品和1个空白添加样品(实际加入值为已知)。空白烤鳗添加样品的实际加入值水平可选在等于最大残留限量50µg/kg,或方法检测限25µg/kg或略高的实际加入值水平上操作;空白鳗鲡和其它养殖鱼类水产品的添加样品可以在方法检测限10µg/kg或略高的实际加入值水平上操作。空白样品和空白添加样品的提取净化和测定步骤同上。本试验用于计算试验的回收率RC,试验的回收率用于对阳性的残留结果进行残留量的校正。回收率RC按公式(1)计算。

  Rc=〔(空白添加样品的残留量测定值-空白样品的残留量测定值)〕/空白样品中药物实际加入值*100%.....(1)

  6.3.4 结果计算与报告

  6.3.4.1 试样中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留量(待校正值)按公式(2)计算。

  C=〔(A*Cs*V)/(As*m)〕*1000.................................................................(2)

  式中:

  C--样品中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留量,µg/kg;

  A--样品溶液中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星的峰面积或峰高;

  As --标准工作溶液中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星的峰面积或峰高;

  Cs --标准工作溶液中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星的浓度,µg/mL;

  V --样品溶液最终体积,mL;

  m --样品的称取量,g。

  6.3.4.2 结果的校正与报告

  结果报告值

  Cr=C/R.........................................................................................(3)

  式中:

  Cr --经过回收校正的样品中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留量,µg/kg

  C --未校正的样品中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星残留量,µg/kg;

  Rc --回收率,%。

  6.3.5 方法相对偏差

  两次平行测定结果的结果报告值相对偏差不大于15%。

  7、线性范围、检测限、回收率和精密度

  7.1 线性范围

  本方法仪器检测线性范围为0.05µg/mL~1.0µg/mL。

  7.2 检测限

  鳗鲡及其它养殖鱼类水产品的检测限恩诺沙星为10µg/kg,环丙沙星为10µg/kg,诺氟沙星为10µg/kg,氧氟沙星为10µg/kg。烤鳗制品的检测限恩诺沙星为25µg/kg,环丙沙星为25µg/kg,诺氟沙星为25µg/kg,氧氟沙星为25µg/kg。

  7.3 回收率和精密度

  方法回收率和精密度见表1

表1 方法回收率和精密度

项   目

添加浓度,µg /kg

回收率,%

RSD,%

恩诺沙星

10

80.0~120.6

5.6

20

74.0~74.5

4.6

50

76.6~87.0

6.1

环丙沙星

10

90.8~100.6

7.5

20

66.9~72.2

6.8

50

65.2~76.1

9.1

诺氟沙星

10

80.4~107.4

6.3

20

67.0~68.1

8.5

50

65.0~75.1

8.0

氧氟沙星

10

70.1~100.8

5.2

20

71.0~77.2

6.6

50

70.8~78.4

9.0

 

 

 

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